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      SUPERSWITCH? RACE cDNA Synthesis Kit

      貨號 ST0011S 售價 7800
      規格 5T CAS號
      • 產品簡介
      • 相關產品

      SUPERSWITCH?RACE cDNA Synthesis Kit

      I.簡介
             SUPERSWITCH? RACE cDNA合成試劑盒通過擴增基因的5'和3'末端精細、有效地完整克隆基因。SUPERSWITCH? RACE方法可有效地在樣品cDNA 5 '和3 '末端加入人工接頭,盡可能地形成最完整的RACE產物。反轉錄步驟后合成的第一鏈cDNA可直接用于5'和3' RACE PCR反應,無需再進行繁復的第二鏈cDNA合成和接頭連接的過程。其他RACE方法均因擴增的高背景和截短的5 '末端而存在明顯的劣勢。優化后的方法既便是在樣本很小的情況下,也可以顯著降低非特異性的擴增,且只需單一PCR管和兩步法的程序就可使您的RNA樣品合成cDNA。
      此外,SUPERSWITCH?技術由于避免了接頭連接的步驟,在RACE PCR過程中直接使用cDNA作為模板,從而降低了RACE的過程的復雜性,并使其更快捷(Chenchik et al,1998),操作時間更縮短至4個小時。
      SUPERSWITCH? PCR RACE Kit也對PCR過程也進行了優化,增加RACE反應的靈敏性的同時,降低了試驗背景。因此,試驗者可用很少的mRNA或是總RNA作為反轉錄的模板來構建全長cDNA。

      II.  SUPERSWITCH? cDNA 合成技術

      通常cDNA的合成方法均通過逆轉錄酶(反轉錄)將mRNA反轉錄成第一鏈的單鏈cDNA(single-stranded cDNA,ss cDNA)。受限于反轉錄的效率,基因的5'端在反轉錄過程中常常不能被轉錄,最終形成的cDNA的5'端通常并不完整。在基因序列較長、mRNA連續出現二級結構,特別是僅以oligo(dT)引物合成第一鏈cDNA的情況下,5'端cDNA鏈合成截短的現象尤為突出。以未降解的RNA構建的cDNA文庫中,出現的截短的cDNA的分子常因反轉錄過程異常終止所致。但無論如何,SUPERSWITCH?方法能夠優先富集的全長cDNA片段。


      第一鏈cDNA合成由優化的oligo(dT)引物起始。反轉錄至mRNA模板5'末端時,反轉錄酶的末端轉移酶活性會在cDNA 3'端加入dC殘基。SUPERSWITCH? 5RRT引物與cDNA 3'端加入dC殘基間的退火為SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase的反轉錄提供了可供延伸的模板。


            SUPERSWITCH?可將多聚腺苷酸mRNA或總RNA反轉錄合成cDNA。而反轉錄合成使用的引物均經過反復優化(3' SUPERSWITCH? 3RRT1/ 3RRT2 )(圖1) 。反轉錄進行至基因mRNA的5' 末端時,SUPERSWITCH?的末端轉移酶活性可在cDNA的3'末端增加以胞嘧啶C為主的其他核苷酸。由于SUPERSWITCH? 5RRT引物在其3'末端富含胸腺嘧啶G,這樣通過C-G之間的堿基配對,反轉錄的cDNA又以5RRT為模板進行延伸,直至5RRT引物的末端(Chenchik et al ,1998)。最終獲得的完整的單鏈cDNA包括完整的5'端基因,以及與SUPERSWITCH? 5RRT引物互補的序列。SUPERSWITCH? 3AP和SUPERSWITCH? 5AP的引物擴增形成了cDNA的5'末端至3'末端的擴增。反轉錄過程進行至mRNA模板5'末端中止前,全長cDNA-RNA分子間的堿基配對效率要遠遠高于SUPERSWITCH? 5RRT與RNA分子的配對。因逆轉錄活性不完全形成的序列不完整的cDNA或是基因組DNA污染將以非指數型進行擴增。需要注意的是,如果初始的轉錄本中含有降解的RNA模板,也會因SUPERSWITCH? 3AP和SUPERSWITCH? 5AP的擴增出現在最終構建的PCR產物中。
      III.操作簡述
      1.引物設計(詳見第Ⅵ節A)
             無論是5'-RACE和(或)3'-RACE反應都必須要設計基因特異性引物(gene-specific primers,GSP),分別命名為GSP1和GSP2。各自的巢式PCR基因特異性引物(NGSP1和NGSP2)可用于RACE產物的分析。在某些情況下,這些巢式的引物也可用于RACE PCR反應。第Ⅵ節中會詳述引物設計的方法。圖2顯示了SUPERSWITCH? RACE反應中所使用的引物與其序列來源的相對關系。


      2.第一鏈cDNA合成(詳見第Ⅷ節)
            SUPERSWITCH? RACE Kit可以合成兩種類型的cDNA——5'-RACE用的cDNA和3'-RACE用的cDNA,但只有5'-RACE用的cDNA 具有延長的5'末端。5'-RACE用的cDNA是以改進過的錨定oligo(dT)引物和SUPERSWITCH? 5RRT反轉而成。改進過的錨定oligo(dT)引物名為SUPERSWITCH? 3RRT1,在其3'端有兩個兼并的核苷酸。這些兼并核苷酸位于poly A+尾的前兩位,與經典的oligo(dT)引物相比可降低3'結合的非均質性(Borson et al ,1992)。3'-RACE用的cDNA則以特殊的oligo(dT)引物在傳統的反轉錄程序下反轉而成。 
      3.RACE PCR反應(詳見第IX節)
            只要使用不同的基因特異性引物,反轉錄后的RACE用cDNA就可用于多個基因的5'-和3'-RACE擴增。SUPERSWITCH? RACE操作體系中附帶的SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase(BT0012)是重組Taq DNA聚合酶和其抗體的混合物,Taq DNA聚合酶具有3′至5′核酸外切酶的活性,大幅提高了PCR擴增的保真度;而添加的Taq DNA聚合酶抗體則提高了PCR反應的特異性、靈敏度和產量。經PCR條件優化后可擴增長度達12~20 kb的片段。因此,SUPERSWITCH? Hot Start PCR Kit可高效、便捷、精確地以cDNA為模板進行長距離PCR(long distance PCR,LD PCR)(Barnes, 1992;Cheng et al 1994),適于高保真地擴增復雜或高GC含量的模板。
      4.鑒定RACE產物(詳見第Ⅹ節)
             在構建全長cDNA*前,強烈建議通過以下步驟確認目的序列:(1) GSP1和SUPERSWITCH? 5AP、NGSP1和SUPERSWITCH? 5AP兩種PCR產物的比較;(2)以內部序列(如NGSP1)標記的引物對PCR產物進行Southern blot分析;(3) 對RACE產物進行克隆和測序,至少獲得部分的序列信息。
      *“全長”cDNA:沒有任何一種cDNA合成的方法可以保證一定得到全長的cDNA,尤其是5'末端。確定5'末端的真實性需要結合RNase保護分析、引物延伸分析和/或cDNA或是基因組的序列信息。大多數的SUPERSWITCH? RACE cDNA包括具有全長的5'末端的cDNA,但是在某些情況下如果具有復雜的二級結構RNA或是cDNA將會阻斷反轉錄或PCR過程。與傳統RACE或是文庫的方法獲得的cDNA相比,SUPERSWITCH? RACE全長cDNA的比例更高。為了最大限度獲得序列的5'末端,在進行5'- RACE試驗的時候,至少測序的克隆數為5~10個。
      即使是兩次RACE反應均為單一產物,上述對RACE產物的定性試驗也可以避免在之后的試驗中浪費您的時間,或是導致試驗的假陽性。在發現有多條基因的RACE產物,或是克隆的目的基因為某個基因家族的某一成員的情況下,這些試驗對得到正確的結果尤為重要。
      IV.SUPERSWITCH?試劑盒組分
            所有試劑均保存于-20℃。需要注意的是SUPERSWITCH? RACE cDNA 合成試劑盒分為動物來源(ST0011)、植物來源(ST0091)和具polyA尾的RNA病毒(ST0111)3種不同規格,請根據試驗樣品購買相應的試劑盒,以達到最好的試驗效果!

      目的

      試劑

      ST0011/ ST0091/ ST0111

      S/5

      L/10

      1

      SUPERSWITCH? 3RRT1 Oligonucleotide

      6μL

      12 μL

      2

      SUPERSWITCH? 3RRT2 Oligonucleotide

      6μL

      12 μL

      3

      dNTP Mix (10 mM)

      20 μL

      40 μL

      4

      Deionized H2O

      100 μL

      100 μL

      5

      5X First-Strand Buffer (RNase-Free)

      30 μL

      60 μL

      6

      SUPERSWITCH? Buffer

      5 μL

      10 μL

      7

      SUPERSWITCH? Buffer

      5 μL

      10 μL

      8

      RNase Inhibitor (40 U/μL)

      6 μL

      12 μL

      9

      SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase (200 U/μL)

      6 μL

      12 μL

      10

      SUPERSWITCH? 5RRT Oligonucleotide

      6 μL

      12 μL

      PCR

      11

      5AP PCR Primer (12 μM)

      30 μL

      60 μL

      12

      3AP PCR Primer (12 μM)

      30 μL

      60 μL

      13

      10×SUPERSWITCH? Hot Start Buffer

      100 μL

      200 μL

      14

      dNTP Mix (2.5 mM of each dNTP)

      200 μL

      400 μL

      15

      SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase(5U/μL)

      10 μL

      20 μL


      1.cDNA合成部分
      ? SUPERSWITCH? 5RRT:用于cDNA 3'接頭(對應mRNA 5'端)引物的跳轉;
      ?SUPERSWITCH? 3RRT1:用于起始第一鏈cDNA合成;
      ?SUPERSWITCH? 3RRT2:用于起始第一鏈cDNA合成,該引物帶有cDNA 5'接頭(對應mRNA 3'端);
      2.PCR擴增部分
      ? SUPERSWITCH? 5AP:為SUPERSWITCH? 5RRT的部分序列,用于基因的5' RACE試驗
      ? SUPERSWITCH? 3AP:為SUPERSWITCH? 3RRT的部分序列,用于基因的3' RACE試驗

      .     Ⅴ 注意事項

      1.SUPERSWITCH? 技術所需的模板跳轉過程需要使用M-MuLV RNase H點突變的反轉錄酶。SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase是一種遺傳修飾的M-MuLV反轉錄酶,該酶具有RNA和DNA依賴的聚合酶活性,但是缺乏RNase H活性(該活性區域點突變),不能降解第一鏈cDNA合成時形成的RNA-DNA復合物中的RNA,因而可獲得全長的cDNA。在42~55℃范圍內SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase均有酶活性,因此適合逆轉錄具有較多二級結構的RNA分子。

      2.SUPERSWITCH?試劑盒所優化的操作步驟適用于總RNA和mRNA模板。第一鏈cDNA合成所需的最小起始量為50 ng的總RNA或是25 ng的mRNA。但是如果樣品RNA的取材不受限制,我們強烈建議以1 μg的總RNA或是0.5 μg的mRNA起始第一鏈的cDNA合成。

      3.無論您以何種目的使用該試劑盒,試驗的成功與否取決于起始樣品的總RNA或mRNA的質量。

      4.在進行第一鏈cDNA合成前,我們強烈推薦以甲醛/EtBr/瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性的檢測。哺乳動物的總RNA 28S和18S帶電泳條帶接近于4.5 kb和1.9 kb分子量的Marker。28S與18S的比值接近于1.5~2.5:1。完整的哺乳動物mRNA電泳顯示為分布于0.5~12 kb間的彌散條帶,并伴有微弱的28S和18S rRNA條帶。非哺乳動物(如植物、昆蟲、酵母和兩棲動物)的mRNA電泳則可能在0.5~3 kb間彌散分布。

      5.操作過程中佩戴口罩和手套可降低RNA和cDNA樣品被核酸酶降解的風險。

      6.本操作過程中的循環參數設置已在自動熱蓋的PCR儀中反復優化,但是仍需根據您的PCR儀和模板優化試驗循環參數的設置。

      7.為使PCR反應管中的試劑混合均勻,須輕柔吸打溶液,并瞬時離心,使反應液沉積于PCR反應管底部。

      8.未注明的情況下,所有操作均在冰上進行。

      9.反應體系中的酶需要最后添加,并輕柔吸打溶液,使酶與反應體系中的其他組分充分混勻。

      10.由于反應體系中的各組分均經過反復優化,酶和模板的量請勿隨意增減。

      11.RACE PCR的有效性取決于RNA樣品中您的目的基因的表達豐度。此外,不同引物也會有不同最適的退火和延伸溫度。

      VI.引物設計
      1.引物設計
      基因特異性引物(Gene-Specific Primers,GSPs)應該具有以下特征:
      ? 20~28個核苷酸;
      ? 40~70% GC;
      ? Tm≥50℃。
      SUPERSWITCH? RACE反應所使用的引物與模板和所得到的RACE產物的關系見圖2。完整的SUPERSWITCH? RACE操作至少需要2條基因特異性引物——5'-RACE PCR所需的反義鏈引物(GSP1)和3'-RACE PCR 所需的正義鏈引物(GSP2)。如果只做5'-或3'-RACE,設計一條GSP及其內部的NGSP即可滿足試驗要求。引物長度最好是20~25個核苷酸,避免使用過短或過長的引物。
      如圖2所示,基因特異性引物的5'-RACE和3'-RACE擴增產物間最好存在重疊區。重疊區內如有合適的限制性酶切位點,可以通過酶切和連接反應獲得全長的cDNA。若設計的兩個基因特異性引物RACE產物間有100~200 bp的重疊區,這兩條引物就能用于PCR反應的陽性對照。當然,GSP不一定必須有重疊區。在cDNA較長或豐度較低的情況下,引物最好設計在靠近cDNA的末端,兩條引物間可以不存在重疊。此外,引物自身也可以重疊(如互補)。
      基因特異性引物GC含量要在40%~70%間,Tm值一般在65℃以上,DNAman軟件melting temperature分析獲得的Hybridization Tm值最好超過50°C(Freier et al,1986)。我們的試驗結果表明,RACE的PCR擴增時,尤其是那些表達豐度低或有存在復雜的二級結構的樣品擴增時,序列較長且Hybridization Tm值超過55°C的引物可以得到更為穩定的結果。此外,設計Tm值接近的GSP1和GSP2更有助于SUPERSWITCH? RACE的試驗。通過計算或PCR的溫度梯度試驗均能得到GSP1和GSP2的適宜退火溫度。需要注意的是,要避免使用自身帶有二級結構的引物。
      注意:不要在GSPs的5'末端和/5'和3'末端加入酶切位點,這些附加的序列將增加PCR的反應背景。
      2.基因內引物序列的位置
      我們使用SUPERSWITCH? RACE Kit從GSP擴增至基因的5' cDNA和3' cDNA末端最長片段的為6 kb。但為了得到較好的結果,推薦設計的GSP到5' cDNA和3' cDNA末端不超過3 kb。
      3.GSP的巢式引物
      在cDNA制備完畢后的第一次擴增時,不建議使用GSP的巢式引物。GSP和SUPERSWITCH? 5AP或SUPERSWITCH? 3AP一般都會造成擴增的背景。但是以GSP的巢式引物(NGSP1 and NGSP2)作為探針對RACE產物進行Southern blot分析有助于鑒定RACE PCR產物。此外,初次GSP擴增時,背景較高,或是有非特異性性擴增時,也需要以巢式基因特異性引物進行巢式PCR。
      如果第一條基因特異性引物和SUPERSWITCH? 5AP或SUPERSWITCH? 3AP擴增的結果為彌散產物,取適當體積(1/10~1/1000)利用GSP的巢式引物(NGSP1或NGSP2)和SUPERSWITCH? 5AP或SUPERSWITCH? 3AP進行第二次擴增。GSP的巢式引物的設計也應當遵循上面的原則。并且GSP的巢式引物不應與GSP的序列有重疊。已知的序列本身如果很短,巢式引物3'的序列應盡量具有唯一性。

      VII.總RNA和m RNA制備與處理
      1.一般提示:
      ? 全程佩戴并經常更換手套及口罩,以避免RNA和cDNA的降解!
      ? 懸浮沉淀或是進行溶液混合的過程中,用槍頭輕柔吸打溶液,或是輕彈離心管底部,使其混合均勻?;旌贤戤吅筮M行瞬時離心,保證所有的組份均集中于離心管底部。懸浮沉淀過程中不要使用漩渦混合器混合樣品,避免造成核酸斷裂!
      ? 未特殊注明的情況下,所有操作均應在冰上進行。
      ? 反應體系中的酶需要最后添加,并保證將酶完全加入已經配好的混合物后,輕柔吸打溶液,使酶與反應體系中的其他組分充分混勻。
      ? 由于本試劑盒內提供的所有的反應體系及試劑均經過反復調試,因此切勿隨意增減反應的試驗體系! 
      ? PCR管與吸頭均為一次性使用。
      2.RNA分析
      在進行第一鏈cDNA合成前,我們強烈推薦以甲醛/EtBr/瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性的檢測。哺乳動物的總RNA 28S和18S帶電泳條帶接近于4.5 kb和1.9 kb分子量的Marker。28S與18S的比值接近于1.5~2.5:1。完整的哺乳動物mRNA電泳顯示為分布于0.5~12 kb間的彌散條帶,并伴有微弱的28S和18S rRNA條帶。非哺乳動物(如植物、昆蟲、酵母和兩棲動物)的mRNA電泳則可能在0.5~3 kb間彌散分布。
      如果試驗樣品的mRNA明顯小于預計的大?。ㄈ缧∮?~5 kb),我們建議在確認RNA純化試劑未被RNA酶和其他物質污染的情況下,重新制備試驗樣品所需的RNA。如果新制備的RNA經重新檢測后仍小于預計的大小,則需要通過其它的細胞或組織提取RNA。

      VIII.第一鏈cDNA合成
      未注明的情況下,所有操作均在冰上進行。進行說明書中有明確溫度要求的操作時,應該在PCR儀的反應模塊溫度與設置溫度一致后,再將PCR反應管放在PCR儀的反應模塊上。反應體系中的酶需要最后添加,并輕柔吸打溶液,使酶與反應體系中的其他組分充分混勻。反應體系中的各組分均經過反復優化,酶和模板的量請勿隨意增減。
      1.每個樣品及對照均在200 μL或500 μL PCR反應管內添加下列組分,吸打混勻,并瞬時離心。
      制備5'-RACE用的cDNA:

      RNA樣品*

      1~6 μL

      1~12 μL

      SUPERSWITCH? 3RRT1 Oligonucleotide

      0.5 μL

      1 μL

      dNTP Mix(10 mM of each dNTP)

      1.5 μL

      3 μL

      補足無RNA酶、DNA酶去離子水至總體系

      8 μL

      16 μL(推薦)




      * (0.025~1 μg mRNA或0.05~5 μg的總RNA)。


      制備3'-RACE用的cDNA

      RNA樣品*

      1~6.5 μL

      1~13 μL

      SUPERSWITCH? 3RRT2 Oligonucleotide

      0.5 μL

      1 μL

      dNTP Mix(10 mM of each dNTP)

      1.5 μL

      3 μL

      補足無RNA酶、DNA酶去離子水至總體系

      8.5 μL

      17 μL(推薦)

      * (0.025~1 μg mRNA或0.05~5 μg的總RNA)。



      2.    70℃孵育5 min,立即冰浴3 min。瞬時離心使溶液收集于PCR反應管管底。

      3.    在無核酸酶PCR反應管中繼續添加下列組分(注意,添加的組份可配制Mix,也可單獨添加,但每一組份加入后均需馬上吸打混勻,以保證各組份發揮最佳的效果?。?/b>。吸打混勻,避免產生氣泡,瞬時離心收集溶液。

      制備5'-RACE用的cDNA

      5×SUPERSWITCH? First-Strand Buffer

      2.5 μL

      5 μL

      SUPERSWITCH? Buffer

      0.25 μL

      0.5 μL

      SUPERSWITCH? Buffer

      0.25 μL

      0.5 μL

      RNase Inhibitor

      0.5 μL

      1 μL

      SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase

      0.5 μL

      1 μL

      補足水至總體系

      至 12 μL

      至 24 μL(推薦)

      42℃孵育30 min后,12.5 μL反轉錄體系加入0.5 μL ●SUPERSWITCH? 5RRT Oligonucleotide;25 μL反轉錄體系加入1 μL ●SUPERSWITCH? 5RRT Oligonucleotide,吸打混勻,并瞬時離心,42℃繼續孵育1 h。

      制備3'-RACE用的cDNA

      5×SUPERSWITCH? First-Strand Buffer

      2.5 μL

      5 μL

      SUPERSWITCH? Buffer

      0.25 μL

      0.5 μL

      SUPERSWITCH? Buffer

      0.25 μL

      0.5 μL

      RNase Inhibitor

      0.5 μL

      1 μL

      SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase

      0.5 μL

      1 μL

      補足水至總體系

      至 12.5 μL

      至 25 μL(推薦)


      42℃孵育1 h 30 min。

      注意:若使用水浴或無熱蓋的PCR儀進行42℃孵育,須在PCR反應管中添加礦物油以避免溶液揮發。

      1.    70℃孵育10 min,降至4℃后,將PCR反應管從PCR儀取出,置于冰上,終止第一鏈cDNA合成。

      2.    如果直接進行PCR步驟,吸取1 μL或其整數倍的cDNA至一干凈、冰浴的200或500 μL PCR反應管中作為模板進行后續的PCR反應。如果您在第一鏈cDNA合成為避免揮發使用礦物油,在吸取溶液時應小心避免吸入礦物油。如果第一鏈cDNA合成的產物不立即使用的話,應該進行每管3 μL cDNA的分裝,將分裝后的cDNA保存于-20。該產物可于-20保存1個月。

      至此,您已獲得3'-和5'-RACE用的cDNA。擴增您的目的基因只需少量cDNA即可,制備好的cDNA可用于多個基因的擴增。如果您在完成3'-RACE和5'-RACE后,想用全長cDNA進行長距離PCR(LD PCR)只需留存適量樣品進行PCR即可。


      IX.快速擴增cDNA末端(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)

      5'-RACE和3'-RACE PCR反應組分如表1所示。注意,全部的PCR反應均經過SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase優化。

      1. 制備PCR Mix時注意多制備1份以保證各體系的充足。5'-RACE和3'-RACE反應試劑相同,各組分如下表所示:

      表1 PCR反應組分配制

      組分

      5'-RACE 樣品

      5AP 單引物

      (– Control)

      3'-RACE 樣品

      3AP 單引物

      (– Control)

      10× SUPERSWITCH?

      Hot Start Buffer

      2.5 μL

      2.5 μL

      2.5 μL

      2.5 μL

      dNTP Mix (2.5mM)

      2~2.5 μL

      2~2.5 μL

      2~2.5 μL

      2~2.5 μL

      GSP1(12 μM)

      0.1 μL

      GSP2(12 μM)

      0.1 μL

      5AP(12 μM)

      0.1μL

      0.2 μL

      3AP(12 μM)

      0.1 μL

      0.2 μL

      cDNA(試驗樣)

      0.5 μL*

      0.5 μL*

      0.5 μL*

      0.5 μL*

      SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase

      0.3~0.5 μL

      0.3~0.5 μL

      0.3~0.5 μL

      0.3~0.5 μL

      PCR-Grade Water

      25 μL

      至25 μL

      至25 μL

      至25 μL

      *50 ng~0.5 μg

      **GSP及接頭引物在12 μM的濃度下,25 μL PCR擴增體系的添加體積注意不要超過0.2 μL。引物添加體積過大不僅容易形成非特異性擴增,還容易造成擴增產物的高背景。

      2. 渦旋混勻(切勿產生氣泡),并瞬時離心。

      3. 在200 μL或500 μL PCR反應管中依序添加表1中的各組分,并混合均勻。

      4. 每管中加2滴礦物油,并將管蓋蓋嚴。

      注意:如用具有熱蓋功能的PCR儀可無需添加礦物油。

      5. 使用下列程序啟動PCR儀。根據cDNA的起始模板是mRNA或是總RNA選擇適宜循環數*。

      注意:PCR設定的循環次數取決于目的基因的表達豐度,需要依據不同基因選擇適宜的PCR擴增參數。以之前描述的體系、步驟先運行30或35個循環后,在1.5%的EtBr膠中檢測PCR產物。如果條帶微弱或無帶,將裝有剩余產物的PCR管置于PCR儀上再運行5個循環。最適延伸時間的設置依據所擴增片段的長度。擴增長度為2~4 kb時延伸時間為4 min,目的產物為0.2~2 kb時可將延伸時間降至2 min,5~10 kb的產物則增加至10 min。

      程序(DNAman軟件melting temperature分析獲得的Hybridization Tm值50~70℃):

      ? 35個循環(mRNA):或

      ? 40個循環(總RNA):

      94 30 sec

      50~70℃(設定溫度梯度) 30 sec

      72 3 min*

      *如果片段>3 kb,產物長度每增加1 kb延伸時間延長1 min。

      6.[可選步驟]建議在50~68℃的溫度范圍內選取6個溫度同時進行溫度梯度擴增,每25 μL PCR體系添加cDNA模板0.5 μL。如果初次的PCR反應沒有得到清晰的目的條帶,或是泳道呈彌散狀,可以cDNA或是巢式引物作探針進行Southern blot分析?;蚴且猿彩揭镞M行第2次PCR反應。

       在沒有明顯擴增條帶的情況下,將6管不同溫度梯度下第1次PCR擴增產物各吸取5~15 μL,進行PCR產物回收后,以相同體積的水洗脫,去除第1次PCR擴增產物中的引物及小于100 bp的短片段。第1次PCR產物直接或用水稀釋至1~100 倍后,利用巢式引物和接頭引物進行第2次PCR反應。使用的引物為0.1 μL的SUPERSWITCH? 5AP/3AP和0.1 μL的NGSP,循環次數為30~33個。

       在有明顯條帶的情況下,將有條帶的第1次PCR產物各吸取5~10 μL(存在PCR擴增產物溫度兩側的產物也可以同時進行回收),進行PCR產物回收后,以相同體積的水洗脫,去除第1次PCR擴增產物中的引物及小于100 bp的短片段。將第1次PCR產物直接或用水稀釋至1~100 倍后,利用巢式引物和接頭引物進行第2次PCR反應。使用的引物為0.1 μL的SUPERSWITCH? 5AP/3AP和0.1 μL的NGSP,循環次數為30~33個。

      X.RACE產物鑒定

      本操作手冊推薦對RACE產物進行鑒定,以確定擴增產物為目的片段。這一操作可在已經獲得全長cDNA,甚至得到單一的PCR擴增產物情況下進行,進行該操作的目的主要是為了避免浪費您的試驗時間。在RACE試驗獲得多個PCR擴增產物,或是懷疑擴增的產物為多基因家族的情況下,進行RACE產物鑒定的操作尤為重要。

      產物鑒定的方法有3種可供選擇:  比較以GSP和NGSP獲得的RACE產物;  Southern blotting;  克隆和測序。操作    需要NGSP以分析5'-RACE和3'-RACE產物。Southern blotting和克隆、測序等操作步驟可參見Sambrook & Russell(2001)或是其他適宜的操作手冊。

      1.比較以GSPs和NGSPs獲得的RACE產物

      5'-RACE反應需要比較初次擴增產物(SUPERSWITCH? 5AP和GSP1的擴增產物)與二次擴增產物(SUPERSWITCH? 5AP和NGSP1的擴增產物),相應的,3'-RACE反應則需要比較初次擴增產物(SUPERSWITCH? 3AP和GSP2的擴增產物)與二次擴增產物(SUPERSWITCH? 3AP和NGSP2的擴增產物)。在初次PCR產物為多個條帶,或是非特異性引物進行擴增時,進行這一步驟有助于獲得正確的試驗結果。如果條帶為目的條帶,在以巢式基因特異性引物進行二次擴增的時候,產物會變小,產物片段的差值應與GSP和NGSP之間的距離一致。以SUPERSWITCH? 5AP和GSP1(或SUPERSWITCH? 3AP和GSP2)進行擴增時如果有多個條帶,在以SUPERSWITCH? 5AP和NGSP1(或SUPERSWITCH? 3AP和NGSP2)進行擴增時某些條帶可能會消失。

      2.Southern Blotting分析

          若以巢式的基因特異性引物作為探針(通常是其他的GSP或是NGSPs)進行Southern blotting分析,可確定RACE產物是否為目的產物。初次PCR產物得到多個條帶,或是用非特異性引物進行PCR擴增時,Southern Blotting尤為重要。5'-RACE比3'- RACE更容易出現多個條帶。

      瓊脂糖/EtBr膠檢測RACE產物。

      拍照后,將DNA轉移至標準的尼龍膜上。

      制備與GSP1(或GSP2) 序列不同的雜交探針,末端標記的NGSP1(或NGSP2)也可用作探針。如果試驗的GSP在5'和3'片段有重疊區的話,GSP2可用作檢測5'-RACE產物,GSP1可用作檢測3'-RACE產物。缺刻轉移或是之前克隆的部分cDNA的隨機引物內部限制性酶切片段均可用作探針。

      Southern blotting與探針進行雜交,在中等~高度嚴謹的條件下進行洗膜和曝光。

       將Southern blotting的雜交圖和電泳照片進行比對。一般來講,傾向于分離Southern blotting膜中最大的RACE產物所對應的條帶。如果凝膠電泳中存在某些更大的產物但并不能與基因特異性引物雜交,這些產物一般可以確定為非特異性擴增。小于目的產物,且能與探針雜交的條帶可能是不完整的轉錄產物,但是也不能完全排除,這些短的條帶可能來源于正確的基因可變剪接產物,或來源于多個啟動子的轉錄本,或是來源于多基因家族。

      一旦得到一條或數條目的條帶,需以膠回收試劑盒分離相應的目的片段,繼續進行試驗。

      3.RACE產物的克隆和測序

       對目的條帶進行切膠純化,并克隆至T/A克隆載體。

       對5'-RACE產物,我們推薦挑取8~10個不同的克隆以最大可能地獲取完整的5'末端。一旦獲得含有最長片段的克隆,即可進行測序。理論上您可以獲取整個的開放閱讀框、5'和3'非翻譯區。

        XI.常見問題及解決方案

      5'-RACE和3'-RACE反應一般都可以進行優化,這種反應體系的優化也是試驗所必需的。優化的內容包括提高目的片段的產量、減少非特異性擴增的背景和/或不完整的RACE產物。本操作手冊推薦的cDNA合成方法制備的5'-RACE和3'-RACE用的cDNA足夠進行100次以上的RACE PCR反應,因此有充足的模板可用于優化RACE擴增。

      1.第一鏈cDNA合成和SUPERSWITCH? PCR擴增

      如果目的產物較?。ㄐ∮? kb),產量較低,或無PCR產物須檢查以下步驟以確定反轉錄步驟的正確性。

      SUPERSWITCH? 試劑盒中附帶的SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase等,均可實現反轉錄過程的模板跳轉。SUPERSWITCH? 技術所需的模板跳轉過程需要使用M-MuLV RNase H點突變的反轉錄酶。SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase是一種遺傳修飾的M-MuLV反轉錄酶,該酶具有RNA和DNA依賴的聚合酶活性,但是缺乏RNase H活性(該活性區域點突變),不能降解第一鏈cDNA合成時形成的RNA-DNA復合物中的RNA,因而可獲得全長的cDNA。在42~55℃范圍內SUPERSWITCH? Reverse Transcriptase均有酶活性,因此適合逆轉錄具有較多二級結構的RNA分子。

       RNA可能在貯存和(或)第一鏈合成的過程中發生降解。起始反應物中低品質的RNA將會降低全長cDNA合成的能力。RNA須于-70℃貯存。工作區域、設備及溶液中都不能含有RNase A。

       操作過程中可能使用了不適宜的孵育溫度或是遺漏了某一或某些重要組分。仔細檢查操作過程,并重復第一鏈cDNA合成和PCR反應。

       需優化PCR的條件及參數。不同的PCR儀、聚合酶或是RNA樣品應該修正PCR的循環次數。如果PCR反應的平臺期出現在24個循環或之后,說明PCR的反應條件并非最佳,需進行調整,并以新制備的0.5 μL(或其整數倍的)第一鏈產物重復PCR步驟。

      PCR產物量較低,或是得到的PCR產物較短。通常RNA樣品濃度較低或是降解時會出現這樣的結果,此外,樣品中含有抑制第一鏈cDNA合成的物質也會產生這種現象。如果樣品來源于非哺乳動物,該物種可能的確會出現類似的PCR產物。如果RNA樣品來源于非哺乳動物,顯然截短的PCR產物可能與該物種RNA正常大小的分布有關。以昆蟲為例,正常的RNA分布就是小于2~3 kb。因此有必要在甲醛變性膠中檢測試驗樣品RNA的含量及完整性。

      樣品中RNA含量較低,但品質很好時,可以通過增加反轉錄過程中RNA模板的含量,或是增加PCR過程中的循環次數進行優化。

      在合成第一鏈之前樣品就(因含有RNA酶)存在部分降解時,需重新制備RNA,并吸取一小部分在42℃孵育2 h,通過甲醛變性膠電泳比較樣品孵育前后的狀態。如果RNA在孵育過程中發生降解,也將影響第一鏈的cDNA合成。因而需要以其它方式重新分離RNA。多次的酚:氯仿抽提可以顯著增加RNA的穩定性。

      若樣品中含有抑制cDNA合成的成份,以80%的乙醇洗滌兩次可以除去某些水溶性成份,如果這一方法仍不奏效,需要以其它技術或RNA分離試劑盒提取RNA。

      2.對照PCR反應

      SUPERSWITCH? 5AP/3AP單引物擴增cDNA的陰性對照。小于35個循環時,應該不出現擴增產物。如果該對照的擴增產物為彌散條帶或多個條帶形成的ladder,則需要重新修改循環參數。

      3.PCR中一般會出現的問題

       富含GC的模板:如果PCR產物,尤其是5'-RACE產物,未出現目的條帶, 或是非預期條帶,可能是由于模板GC含量較高。試劑盒中提供的 SUPERSWITCH? Hot Start DNA polymerase可用于擴增富含GC的模板。但是PCR mix的體系和參數還需依據模板進行修正。

      高保真PCR:若RACE產物還用于其他分析或研究,可以用高保真酶擴增全長cDNA。

       降落PCR的問題:出現問題時應首先修正程序最后設定的循環數(即68℃運行的30~35個循環)。若電泳檢測后發現無擴增產物,可將剩余產物重新置于PCR儀上再運行5個循環。如果還沒有,可在68℃再運行3~5個循環。若仍無產物,請重新進行PCR擴增,并將第3次循環的退火溫度降至68℃到65℃之間的某一溫度。如果GSP的Tm值接近70℃,上述程序的改進會比較有效。

      4.3'-RACE成功,但5'-RACE無擴增產物。

      這種情況常常是由于未能合成全長cDNA和/或未進行模板跳轉反應,應重新合成第一鏈cDNA。

      另外,合成的cDNA已經降解。反轉錄后的產物未于-20℃凍存,或使用后未及時于-20℃凍存,或頻繁凍融cDNA都會出現這一情況。

      5.RACE反應中都未出現擴增條帶

      PCR(尤其是5'- RACE和3'-RACE)的30~35個循環之后還未發現擴增條帶,將剩余產物重新置于PCR儀上再運行5個循環。需要根據不同的PCR儀優化PCR反應體系及參數。如果這些方法都不奏效,則可能是由于cDNA合成和/或模板跳轉反應失敗造成的,需要重新合成第一鏈cDNA。

      6.樣品制備的第一鏈cDNA,5'-或3'-RACE均無目的條帶。

      需要首先確認目的基因是否表達!

      如目的基因在您使用的RNA中表達豐度并不高時,可在原PCR循環數上再多運行5個循環,直至RACE產物出現,但是降落PCR的循環數不要超過50個,非降落PCR的循環數不要超過41個。若仍無目的條帶,需要在目的基因表達豐度較高的樣品中重復試驗。

      設計的基因特異性引物的退火溫度低于68℃,可以進行50~70℃之間的溫度梯度試驗。

      設計的基因特異性引物不適用于該PCR體系。以第Ⅵ部分引物設計的原則檢查引物的設計是否合理,并視需要重新設計引物。

      由于目的基因富含二級結構和/或富含GC,難于進行PCR擴增。在靠近cDNA末端的位置重新設計引物。如已知某區域富含GC,避免在該區域設計引物。

      目的基因太長,不能完全反轉和/或進行長距離PCR。盡可能在靠近cDNA末端的位置設計引物,并重新以基因特異性引物或是6核苷酸的隨機引物代替試劑盒中的SUPERSWITCH? 3RRT1重新合成第一鏈cDNA。

      從總RNA中純化出mRNA后,再進行反轉錄,可大大提高基因5' -RACE的成功率。

      7.RACE產物含有多個條帶。

      某些情況下,試驗樣品會產生多個5'-RACE和/或3'-RACE產物。如上文所述,這種情況下,需要判定哪一(或哪些)條帶為目的片段,哪些為假陽性片段,確定目的片段和全長片段需要確定轉錄起始位點、內含子/外顯子結構、多腺苷酸化位點和基因組測序等研究工作,利用下面的方法有助于剔除假陽性片段。

      多條產物并不表示不能得到全長cDNA。若能剔除非特異性條帶,最終也能節約試驗時間。通常以每次RACE產物中的得到的最長的片段進行下面的試驗就能獲得真正的、完整的RACE產物。

       “陽性”多條RACE產物的來源

          個別基因由于存在多個轉錄本會形成多個RACE片段,機制通常分為以下3類: mRNA的可變剪接可形成多個5'-或3'- RACE產物;不同的轉錄起始位點可形成多個5'-RACE產物;不同的多聚腺苷酸化位點可形成多個3'-RACE產物。

          另一方面,目的基因可能是多基因家族的成員之一,由于基因家族間序列的相似性,設計的基因特異性引物可在多個基因間進行PCR擴增。

          區分真正的序列不同的RNA屬于科學研究的范疇,但是,通過本試劑盒能發現某一來源的RNA表達豐度要高于其他來源的RNA。

       假陽性產物的來源

      多條擴增產物通常并不實際對應真實、完整的轉錄本。這些假陽性的RACE產物可分為兩類,即不完整的RACE產物和非特異性的RACE產物。

      正確的引物結合位點的不完整擴增片段可能是以下幾個原因造成的:因反轉錄中止而產生的不完整的第一鏈cDNA通常會形成多條的5'-RACE產物。在RNA分子較大時這種現象尤為普遍,但也較為難以解決,因為這一現象是由反轉錄過程的內在缺陷決定的,很難克服;以降解的RNA起始第一鏈cDNA的合成通常會形成多條的5'-RACE產物;某一特定基因因模板的高GC含量使PCR擴增過程十分困難,也會導致形成多條5'-或3'-RACE產物;非特異性RACE產物則來源于引物與雙鏈cDNA的多個非特異性的結合位點結合,或是由引物二聚體造成的假陽性。

      建議:

      注意一定要進行推薦的對照PCR擴增,并且GSP的單引物擴增不應有條帶,而與接頭引物結合進行擴增時應只有單一條帶。若GSP的單引物擴增有條帶的話,應修改循環參數或設計NGSP;使用5 μL 5~10倍稀釋的RACE-Ready cDNA重復PCR擴增;檢測用于第一鏈cDNA合成的RNA(見第Ⅶ部分)。如果RNA分子量低于理論值,重新進行RNA提取和cDNA合成的步驟。

      采用以上操作后,如果仍有多個條帶,依據以下方式改進PCR循環參數:以2~5℃為一個單位升高PCR的退火溫度,以增加PCR的嚴謹性。一般非特異性擴增的條帶會消失,只保留正確或不完整的目的基因擴增產物;減少循環次數;減少延伸時間;RACE產物較大的情況下,增加延伸時間也能消除多余的條帶。

      如果經過上述處理還有多個條帶,依據以下方式設計新的一組PCR引物:最好設計巢式的基因特異性PCR引物,其產物大小有一定差別。這兩條基因特異性引物既可以單獨與接頭引物組合后使用,也可以第1次PCR的產物做為模板進行巢式PCR。與任一基因特異性引物擴增相比,巢式PCR通常會降低PCR反應的背景和非特異性擴增,巢式引物的設計請參見第Ⅵ部分。

      與巢式PCR相比,我們首先推薦進行GSP1/NGSP1與5AP的PCR擴增。這兩次PCR的結果有助于顯示多個條帶是特異性還是非特異性的。特異性條帶在兩次擴增中都會出現,但是巢式的基因特異性引物的擴增產物要小一些。兩次擴增產物的堿基數之差與引物設計時對應的cDNA距離一致。如果上述的各種方法均不能得到特異性的結果,應以基因特異性引物和隨機引物代替本試劑盒提供的SUPERSWITCH? 3RRT1/ 3RRT2重新合成cDNA。

      8.RACE cDNA產物為彌散條帶。

      某些RACE產物的條帶非常復雜,呈彌散狀。大多,尤其是3'-RACE反應呈彌散狀,是由于RACE反應前的問題造成的。5'-RACE的彌散條帶通常是因反轉錄的模板或是RNA存在降解造成的。

      合成第一鏈cDNA的RNA中存在污染或是反轉錄過程中出現問題都會造成擴增條帶出現彌散。無論是哪種情況,都應當重新提取RNA后再進行RACE工作(或是確認用于第一鏈合成的RNA不存在污染)。


      XII.參考文獻

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